近日，頂尖學術期刊Nature以封面文章形式發表了gnomAD的系列研究成果，其中Nicola Whiffin等人在Nature Medicine上也發表題為“The effect of LRRK2 loss-of-function variants in humans”的研究論文，該研究系統地分析了來自基因組數據庫gnomAD中測序的141,456名個體、英國生物樣本庫（UK Biobank）中全外測序的49,960名個體、及23andMe公司基因型數據庫中400多萬名個體的LRRK2蛋白編碼基因的功能喪失性（pLoF）變異。經過嚴格的解讀后，鑒定出1,455名攜帶高度可信的LRRK2pLoF變異的個體。結合此前的研究及三種變異的實驗驗證結果，證實了該隊列中82.5％的個體的蛋白水平降低。該研究顯示LRRK2中的雜合pLoF變異降低了LRRK2蛋白水平，但這與任何特定的表型或疾病狀態均未密切相關。該研究結果證明了大規模基因組數據庫和人類功能喪失性攜帶者表型分析對于藥物發現中靶標驗證的價值。 背景介紹 帕金森病（PD）是一種最常見的與年齡相關的神經系統疾病，影響了約1%的60歲以上人群，因此迫切需要新的治療策略。約30%的家族性和3-5%的散發性帕金森病病例與遺傳因素相關。目前已知LRRK2是帕金森病的一個主要致病基因，且已知LRRK2中激酶功能獲得性變異可顯著增加帕金森病的患病風險，這表明抑制LRRK2激酶活性有望成為帕金森病的潛在治療策略。 大規模的人類遺傳學研究是發現和驗證人類治療靶點的越來越強大的數據來源。pLoF變異是一類信息量特別豐富的遺傳變異，預測可主要或完全地消除受累等位基因的功能。這種變異是終生抑制靶基因的自然模型，可以提供有關候選靶標的有效性和安全性的信息。在藥物靶向評估中利用pLoF變異通常需要收集大量具有遺傳特征和表型特征的個體，并對目標基因和候選變異進行深入的研究。 研究人員鑒定出LRRK2 pLoF變異，并評估了三個具有遺傳特征的大型個體隊列的相關表型改變。首先，在兩個大型測序隊列中注釋出LRRK2 pLoF變異，并發現gnomAD中的633名個體和英國生物樣本庫中的258名個體共攜帶150個獨特的LRRK2功能喪失（LoF）性候選變異，其總攜帶頻率為0.48%。整理后去除了其中不太可能導致真正LoF的低質量或注釋錯誤的變異（圖1a）。最終的數據集包括攜帶134個高度可信的pLoF變異的255名gnomAD個體和97名英國生物樣本庫個體（圖1a），其攜帶頻率為0.19%。其次，檢查了來自23andMe公司400多萬名參與者的LRRK2 pLoF變異，并鑒定出8個用功能喪失轉錄本影響評估器（LOFTEE）推定高可信度的LRRK2pLoF變異。人工處理后，每個變異的所有推定攜帶者都提交給Sanger測序驗證，并且排除了小于5個確定攜帶者的變異。由此產生的隊列包括749個個體，每個經Sanger確定的攜帶者都攜帶三種pLoF變異中的一個（圖1a）。這三個組合的數據集共提供了1455名攜帶者個體和134個獨特的LRRK2 pLoF變異。這些變異存在于所有主要的大陸種群中（圖1b），既未表現出任何沿著LRRK2蛋白長度的明顯聚集，也未在任何已知的注釋蛋白質結構域中出現特定的富集或匱乏（圖1c），與真正的LoF特征一致。 圖1. 候選LRRK2 pLoF變異的注釋和管理 a. 流程圖顯示了gnomAD、英國生物樣本庫（UK Biobank）和23andMe隊列中候選LRRK2 LoF變異的篩選和管理。在23andMe隊列中鑒定出的1103名攜帶者中，經Sanger測序驗證確定了749名，其余未經檢測。 b. gnomAD數據庫中LRRK2 pLoF變異攜帶者的祖先分布。AFR，非洲裔/非裔美國人；AMR，美國/拉丁美洲人；ASJ，阿什肯納茲猶太人；EAS，東亞；FIN，芬蘭人；NFE，非芬蘭歐洲人；SAS，南亞。10次以上的pLoF變異以彩色顯示，其余變異則以灰色顯示。大多數LRRK2 pLoF變異在個體間極為罕見（攜帶頻率低于1/10000），除了兩個幾乎只存在于混合美國/拉丁美洲人群體的無義變異（Cys1313Ter和Arg1725Ter）和兩個主要為非芬蘭歐洲人特異性變異（Leu2063Ter和Arg772Ter）。所有變異蛋白的描述均以ENSP0000298910.7為參考。 c. 通過位置標記pLoF變異的LRRK2基因示意圖，其標記高度與gnomAD（灰色條）和英國生物樣本庫（藍色條）中的等位基因數目相對應。其中51個外顯子用不同顏色的矩形表示不同的蛋白質結構域，其余外顯子為灰色。23andMe隊列中基因分型的三種變異用黑色文本標注其樣本數目。 為了證實LRRK2 pLoF變異導致LRRK2蛋白水平降低，研究人員分析了具有三種獨特pLoF變異的細胞系的總蛋白裂解物。在所有情況下，與非攜帶者對照組相比，LRRK2蛋白水平肉眼可見地降低（圖2），這與先前的研究一致。總的來說，此項研究中82.5%（1201/1455）的pLoF攜帶者具有這六個經功能驗證的變異。 圖2. 與無LoF變異的細胞相比，雜合型LRRK2 pLoF變異使LRRK2蛋白降低 a. 對5例無pLoF變異（LRRK2-WT）和3例雜合型（Het）pLoF變異（Cys1313Ter；12-40699748-T-A；Arg1483Ter；12-40704362-C-T）的淋巴母細胞樣細胞系進行LRRK2和上樣對照GAPDH的免疫印跡。實驗重復了十次，結果相似。 b. 對胚胎干細胞分化的心肌細胞中的3個對照細胞系和1個CRISPR/Cas9編輯的LRRK2雜合細胞系（Arg1693Ter-12-40714897-C-T）進行LRRK2、α-輔肌動蛋白（肌肉特異性）和GAPDH的免疫印跡。所有變異蛋白的描述均以ENSP0000298910.7為參考。實驗重復了五次，結果相似。 接下來，研究人員試圖確定LoF引起的長期LRRK2蛋白水平降低是否會導致壽命明顯縮短。在gnomAD或23andMe數據集中，發現LRRK2 pLoF變異攜帶者和非攜帶者的年齡分布無顯著差異（圖3a），這表明對壽命無顯著影響。另外，研究人員進行了一項全表型關聯研究，比較LRRK2 pLoF攜帶者和非攜帶者的366個健康相關性狀，發現任何個體表型與攜帶者狀態之間均無顯著關聯（圖3b）。 圖3. LRRK2 pLoF變異與年齡分布或任何不良表型間均無顯著相關性 a. 在gnomAD和23andMe數據集中，LRRK2 pLoF攜帶者與非攜帶者的年齡分布無顯著差異。注意，此分析基于樣本采集時的年齡。 b. 23andMe隊列中，三種LRRK2 pLoF變異的攜帶者與非攜帶者的全表型關聯研究結果的曼哈頓圖。每個點代表一個不同的表型，并按照相關類別分組（用交替的黑點和灰點表示）。虛線代表366次試驗的Bonferroni校正P值。邏輯回歸用于二元表型，線性回歸用于年齡、性別、基因分型平臺和前10個遺傳主成分的數量表型控制。 英國生物樣本庫資源包括30個血清和4個尿液生物標志物的測量結果。研究者發現這些生物標志物在pLoF的攜帶者和非攜帶者間無任何差異。特別是，轉化為腎功能臨床指標的尿液生物標志物（圖4a）及通常用于評估肝功能的六種血液生物標志物在攜帶者和非攜帶者之間均無差異（圖4c）。同時，肺功能的肺活量測定也無差異（圖4b）。 圖4. LRRK2 pLoF攜帶者無任何肺、肝或腎功能損傷 對于所有曲線圖，每個pLoF攜帶者用青綠色的點表示，非攜帶者用灰色的點表示。平均值和1?×?s.d.用黑色圓圈和線表示。 a. 將尿生物標志物白蛋白和肌酐轉化為腎功能的兩個臨床標志物。pLoF攜帶者未出現腎功能嚴重受損的跡象。ACR，白蛋白與肌酐的比值。 b. 肺功能的年齡、性別和身高校正后的肺活量測定Z評分。FVC，用力肺活量；FEV，1?秒內的用力呼氣量。 c. 肝功能的血清生物標志物。堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、膽紅素和肌酐曲線被截頂，分別去除47、29、92、8和27名非攜帶者。在完整的數據集上計算小提琴圖和匯總統計數據。所有pLoF攜帶者均在每個繪圖區內。 研究人員承認此項研究存在多種局限性。首先，研究所依賴的異質性表型數據主要來自自我報告的問卷調查。23andMe和gnomAD數據集都只記錄了招募時的年齡，這并非一個理想的壽命指標，與帕金森病的典型發病年齡相比，參與者相對年輕。此外，在目前的樣本量下，只能檢測到對壽命的強影響。由于是有針對性的基因分型而非測序數據，因此對23andMe隊列中LRRK2 pLoF變異的調查必然不完全。另外，也未直接評估LRRK2 pLoF變異是否會降低激酶活性，而是將蛋白水平的降低作為一個指標。若發生生物代償，LRRK2的終生LoF可能不等同于治療性失活。最后，LRRK2 pLoF變異自然發生的低頻率導致可用于評估每種生物標記物和表型的攜帶者相對較少，這意味著無法很好地檢測由LRRK2單倍劑量不足而引起的微小或罕見的臨床表型。然而，此項研究表明，任何與LRRK2部分降低相關的臨床表型都可能比早發性帕金森病更為良性。 總結 該項研究為伴有全面變異解讀、具有遺傳特征和表型特征的特大型隊列，在探索候選藥物靶點的安全性時提供了一個重要的原則性證據。在未來的幾年里，能得到數十萬深入分型個體和/或用于基于基因型研究的再聯系個體的完整外顯子組或基因組序列數據，再結合對候選pLoF變異的深入解讀和實驗驗證，將為治療靶點驗證以及更廣泛的人類基因生物學研究提供強有力的資源。 關于基因組學及罕見遺傳病檢測的更多介紹，詳見： 參考文獻：Nicola W, Irina M. A, Aaron K, et al. The effect of LRRK2 loss-of-function variants in humans. Nat Me, 2020, 26(6): 869-877.
